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有机物和试验方法对次氯酸钠杀菌效果影响探究

发布时间:2022年3月2日

2002版《消毒技术规范》中悬液定量杀灭试验(悬液法)和载体定量杀灭试验(载体法)的消毒剂配置、菌悬液配置等均有所不同,这是否会影响同种消毒剂因采用试验方法不同而对其消毒效果评价不同值得研究。

卫生部2007年颁布的《次氯酸钠消毒剂卫生质量技术规范》中的杀菌效果评价试验规定有机干扰物浓度为3g/L,与2002版《消毒技术规范》中规定的30g/L相差10倍,目前已经有很多研究报告证实了有机物对含氯消毒剂杀灭效果肯定有影响。我们于2012年3~4月试验了有机物对次氯酸钠类消毒液杀灭枯草杆菌黑色变种芽孢的影响,以及所造成的杀菌效果程度的差异。本次试验以枯草杆菌黑色变种芽孢为试验菌、某84消毒液为研究对象,比较悬液法和载体法杀菌效果的差异,以及有机物浓度对杀灭效果的影响。

1对象与方法

1.1对象

枯草杆菌黑色变种芽孢(ATCC9372)由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心提供;某84消毒液(有效氯含量为5.5%~6.5%,批号110801,效期12个月),采用硫代硫酸钠滴定。

1.2方法

1.2.1菌悬液及菌片的制备

①菌悬液:取枯草杆菌黑色变种芽孢(ATCC9372),用胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)稀释成所需浓度菌悬液(1×l07~5×107CFU/ml);②菌片:载体法时将菌悬液(用TSB稀释至合适浓度)滴染于不锈钢圆片和布片(1×1cm)上,制成菌片,置37℃干燥30min,菌片菌数为(5×lO5)~5×l06CFU/片)。

1.2.2消毒剂配置

根据含量测定结果,悬液法时消毒剂用无菌标准硬水稀释成试验浓度的1.25倍,载体法时稀释成试验浓度。

1.2.3中和剂

含5g/L硫代硫酸钠的TPS。

1.2.4有机物

牛血清白蛋白,用无菌蒸馏水配制成O、3、30g/L三个浓度。

1.2.5培养基、培养箱

本次试验使用广东环凯公司的普通营养琼脂。生化培养箱PSH-300。

1.2.6中和剂鉴定试验

按中和剂悬液定量鉴定试验操作程序进行,试验设6组,试验温度为20℃,1、2组作用时间为30min。结果判定,当第1组不长菌或远小于第2组,第3、4、5组菌量在1×l07CFU/ml~5×l07CFU/ml之间且三组误差率不超过15%,第6组不长菌时,表明该中和剂适宜。试验重复3次。

1.2.7悬液定量杀菌试验

试验在20℃水浴中进行,设计O、3、30g/L三种浓度有机干扰物与试验菌1:1混合制成菌悬液(有机物浓度为Og/L时用无菌纯水代替),在无菌试管内加入1.0ml菌悬液与40ml消毒液(1.25倍浓度),迅速混匀并立即计时;待作用至各预定时间,分别吸取0.5ml加入4.5ml中和剂中,中和作用10min后进行活菌计数,计算杀灭对数值,结果各次的杀灭对数值均≥5.00,可判定为消毒合格。试验重复3次。

1.2.8载体定量杀菌试验

按每片5.Oml的量,将试验浓度消毒剂加入到一无菌平皿内(阳性对照组用TPS代替),置20℃水浴5min后,将菌片放入消毒液中浸泡,待作用至各预定时间,将菌片分别移入含5ml中和剂的试管中,中和10min后进行活菌计数,计算杀灭对数值,结果各次的杀灭对数值均≥3.00,可判定为消毒合格。试验重复3次。

2结果

2.1中和剂鉴定试验结果

结果表明,含5g/L硫代硫酸钠的TPS可有效中和各组最高试验浓度的84消毒液对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭作用,且中和剂、中和产物对试验菌及培养基无影响。结果见表1。
表1

2.2杀菌试验结果

22.1悬液定量和载体定量杀菌试验结果

在通过中和剂鉴定试验的基础上进行杀菌定量试验,试验结果表明,在含有效氯2500mg/L的84消毒液对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭试验中,悬液法作用45min,杀灭对数值>5.00;载体法(钢片)和载体法(布片)作用30min杀灭对数值>3.00。结果见表2。
表2

2.2.2有机物影响试验结果

结果表明,在含有效氯2500mg/L的84消毒液对枯草杆菌黑色变种芽孢的悬液定量杀灭试验中,作用30min,含Og/L牛血清白蛋白的悬液试验杀灭对数值>5.00,而有机物浓度为3g/L时,需作用45min有消毒效果。结果见表3。
表3

3讨论

试验结果表明,用悬液法评价该84消毒液对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀菌效果比载体法取得同样效果所需时间长。因此,不同试验方法对评价同一种消毒剂的杀菌效果有一定的影响,这种差异可能是因为悬液法中加入3g/L牛血清白蛋白有机干扰物消耗了大量消毒剂,从而削弱了消毒剂的杀菌效果,此对于受有机物影响大的消毒剂(含氯消毒剂、过氧化氢)更为明显。因此在选择杀菌试验方法时应严格按照规范的要求:依据申报单位提供产品研制报告和产品的使用说明书进行检验;用于评价消毒剂消毒效果的实验室试验应以悬液定量法为主,试验需重复3次;对不宜用悬液定量法评价的消毒剂,如粘稠的消毒剂和冲洗消毒剂等的实验室试验用载体定量法,而且在无特殊要求的情况下,以布片为载体等等。有机物浓度对84消毒液消毒效果的影响非常大,有机物浓度越高,对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀菌效果越差,这也与很多相关研究结果相符,这可能与84消毒液的作用机制有关。84消毒液在水中形成的次氯酸不仅可与细胞壁发生作用,且因分子小不带电荷,故容易侵入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏其磷酸脱氢酶,使糖代谢失调而致细胞死亡,次氯酸分解形成新生态氧可奖菌体蛋白质氧化。另其中所含的氯对蛋白质起氯化作用,使细胞膜通透性发生变化,促使细胞内向外渗出,杀死微生物。所以在此类消毒液的现场使用中,尤其要注意适当增加使用浓度,以达到相应的消毒效果。

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